Тема моего доклада: "ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЛОГЕНИИ ВИДОВ СЕМ. OPISTORCHIIDAE С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 9ГО ИНТРОНА ГЕНА ПАРАМИОЗИНА."

слайд 1

Семейство описторхиды относится к типу плоские черви, класс трематода, подкласс дигенея. Представители семейства являются паразитами человека и других позвоночных животных, паразитируют в протоках печени и желчном пузыре. Все представители данного подкласса являются облигатными паразитами и имеют сложный жизненный цикл с чередованием хозяев. Взрослая особь или марита паразитирует на птицах, рыбоядных млекопитающих, а также человеке. Личиночные стадии паразитируют в моллюсках и рыбах. В этой работе использовались стадии марита и метацеркария.

Три вида имеют большое эпидемиологическое значение, образуя так называемую "описторхозную триаду" -- это O. felineus, C. sinensis, O. viverrini. Кроме того, обьектами для нашего изучения являются представители рода миторхис, которые также могут заражать человека, с крайне тяжёлыми последствиями. В некоторых районах трематодозами поражено до 95% населения.

слайд 2

• Ареал O.felineus - от Украины и Белоруссии на западе до Иркутской области на востоке. Также O.felineus присутствует в Европе, но обнаруживается, как правило, только у диких животных. Район обь-иртышского бассейна является самым сильнозаражённым регионом в России и мире.
• O. viverrini распостранён в Тайланде, Лаосе, Камбодже и Вьетнаме.
• C.sinensis распространен в Китае, Японии, Корее, на Тайване, а также на Дальнем востоке России.
• Миторхи распостранены по рекам Сибири, Европейской части России, а также странах Европы, например Германии.

В последние полвека в связи с резко повысившимися процессами миграции человечества, усилились процессы изменения ареалов описторхид в мире, и крайне необходимо наличие видоспецифичного маркёра.

Видовое определение видов трематод традиционными методами возможно лишь для взрослых червей и требует высокой квалификации исследователя, а изучение меж- и внутрипопуляционного разнообразия морфологическими методами практически невозможно. Промежуточные стадии развития описторхиид зачастую вообще не могут быть точно определены морфологическими методами. Одним из подходов к решению этих проблем является анализ нуклеотидных последовательностей генетических маркеров. Обычно в таких исследованиях применяют последовательности либо кластера рибосомальной ДНК, либо фрагментов митохондриальных генов. Нашей задачей было разработать альтернативный ядерный маркер, обладающий большей меж- и внутривидовой изменчивостью, чем рибосомальные последовательности, и провести филогенетический анализ четырех видов семейства Opisthorchiidae.

слайд 3

В качестве такого маркёра нами был выбран парамиозин, белок, встречающийся исключительно у беспозвоночных и выполняющий у плоских червей несколько функций. Первая -- парамиозин является компонентом тонкой мускулатуры и тегумента. Вторая -- парамиозин находится в секрете, выделяемым паразитом, и находится на его поверхности. При этом он связывается с различными компонентами системы комплимента хозяина, и может блокировать имунный ответ. В ряде статей высказывается мнение что в силу своих функций вне организма, он играет роль в процессах взаимодействия паразит-хозяин, а значит подвержен адаптационным процессам, что и обуславливает его высокую вариабельность.

слайд 4

Задачи

1. Подобрать праймеры для амплификации фрагмента гена парамиозина, окружающего 9-й интрон, у описторхид, получить и расшифровать ампликоны;
2. Установить размах вариабельности этого генетического маркера;
3. Провести филогенетический анализ.

слайд 5

На базе ФНЦ НПУ Вектор проводились исследования по кДНК парамиозина у O. felineus. Также, на момент начала исследования была известна последовательность мРНК гена у C. sinensis. Нами был проведен сравнительный анализ с последовательностью гена у цестоды T. solium, с целью определения экзон-интронных границ. На основании данных был выбран 9-й интрон гена. В консервативных участках были подобраны сайты для пар внешних и внутренних праймеров.

слайд 6

Нами были получены следующие образцы:

1. Фелинеус из Новосибирска, новосибирской области, томска и томской области
2. Синенсис из Хабаровского и приморского краёв
3. Виверини из Тайланда
4. Меторхи из новосибирска, Челябинской области и приморского края
5. Неопределённый вид из подсемейства описторхина, из озера Мураши, Новосибирской области

слайд 7

Полученный нами ампликон имеет длину 222 нуклеотида, и включает в себя 106 нуклеотидов в экзонной части, длина интрона составила 116 нуклеотидов.

Следует отметить такие характерные черты интрона у разных видов описторхид, как:

• у O. viverrini наблюдается делеция в 20 нуклеотидов начиная с 9 позиции в интроне.
• у образцов рода Metorchis наблюдается инсерция T в 103 позиции интрона, у одного из образцов в дополнении к этому имеется инсерция CC в 70 позиции.

Из литературы и генбанка были взяты длины и последовательности интрона других видов, которые сильно отличались от полученного нами (к примеру Т. солиум, относящеяся к цестодам, имеет длину интрона около 800 нуклеотидов, шистосома мэнсони, из семейства шистоматид -- примерно 2 килобазы (со встройкой мобильного элемента и нескольких повторённых последовательностей.)).

Так как полученный ампликон содержит как интронную, так и экзонную части, их сравнение и изучение проводились независимо.

слайд 8

Экзонная часть имела минимальные вариации, в один-два сайта замены между видами. Фелинеус отличался от других видов наличием одной аминокислотной замены, Glu на Asp. Две дополнительные аминокислотные замены были в гетерозиготных позициях: Leu на Pro для образца O. felineus из Томска и Arg на Leu для C. sinensis из Хабаровского края. Ни из последовательность нуклеотидов, ни аминокислот не удалось создать деревья с нормальным уровнем поддержки ветвлений.

Интрон оказался более успешным для поставленной задачи.

слайд 9

Межвидовое изучение.

При сравнении кластера включающего в себя O.felineus, O.viverrini и C.sinensis, и кластера включающего род Меторхис, различия между образцами миторхисов оказались сильнее чем внутривидовая разница, но меньше чем межвидовая. Возможно, эти образцы принадлежат к близким видам, или же к далеко разошедшимся популяциям. Необходимо дальнейшее изучение этого вопроса, для его разрешения.

При использовании двухпараметрической модели Кимура были высчитаны дистанции между видами. Генетическая дистанция, это число, показывающее степень родства двух образцов.

Внутри подсемейства значения составили от 0.037 до 0.209 для описторхин, и в среднем 0.080 для меторхин. Между подсемействами значения колебались между 0.243 и 0.429.

При использовании экзонов дистанции не превышали 0.019

слайд 10

Межсемейственное изучение

Кроме того, для проверки специфичности маркёра было проведено сравнение между экзонными последовательностями видов, относящихся к разным семействам и отрядам подкласса дигеней класса трематод. Для сравнения были взяты виды S. japonicum, S. mansoni, S. haematobium, относящиеся к семейству Schistosomatidae (отряд ...), и вид Paragonimus westermani, относящийся к семейству Paragonimidae (отряд ...). Вид T. solium, относящийся к классу цестод, был использован в качестве представителя внешней группы.

Дистанции внутри класса трематод не превышали 0.500, наиболее дальними друг-от-друга оказались шистосомы, дистанция между видами доходила до 0.1. Между стригениидами (шистосомы) и описторхидами разница составила в районе .400-.450, между описторхидами и плагиорхитами (парагонимус) -- примерно 0.300.

Между классами дистанция была в районе 1 (0.87-1.05)

Филогения

слайд 11

Полученные нами данные получили подтверждение при филогенетических реконструкциях.

Дендрограммы и кладограммы представляют собою визуализацию дистанций, показывают родство образцов, и время необходимое на эволюцию вида.

При использовании экзонной части было проведено построение филограмм для представителей трематод. При этом, полученная структура совпала с систематикой класса, за исключением семейства описторхид, где вариабельность экзонной части не оказалась достаточной.

слайд 12

Для получения внешней группы для построения по интрону был взят интрон шистосомы, полученный в результате секвенирования в проекте "геном шистосомы", Smp_021920.2, из него были вырезаны мобильные элементы и повторённые последовательности, после чего, полученная последовательность длиной около 400 нуклеотидов была выравнена против интрона O. felineus и M. bilis в программе dialign, которая позволяет выравнивать не нуклеотиды, а блоки нуклеотидов. На слайде показана карта повторённых последовательностей в интроне и получившееся выравнивание. Несовпавшие блоки были выброшены, и полученная последовательность использовалась при построении дендрограмм. Как видно на слайде, это не привело к сильным изменениям топологии и цифрам поддержки.

слайд 13

На деревьях, полученных всеми методами, C. sinensis объединяется с O. viverrini с высокой бутстрепной поддержкой (>80%). К этой ветке прикрепляется образец sp1, но с достаточно низкой степенью поддержки. Данная ветвь, в свою очередь, объединяется с O. felineus также с высокой поддержкой. К ним прикрепляется образец sp1, с достаточно низкой степенью поддержки. Таким образом, полученные результаты хорошо согласуются с морфологическими данными, предполагающими синонимичность родов Opistorchis и Clonorchis. Образцы, отнесенные к роду Metorchis, при филогенетическом анализе образуют отдельную ветвь.

слайд 14

Значимых различий при использовании методов NJ и MP, равно как и при использовании внешней группы, не обнаружено.

слайд 15

Заключение.

Таким образом данный маркёр предоставляет возможности для расширения диапазона сравнительно-эволюционного анализа . Интронная область применима для изучения межпопуляционных отношений и отношений между близкими видами, экзонная же - применима для изучения отношений между более крупными таксонами, где интрон оказывается слишком вариабельным, и достоверность оценок понижается.

слайд 16

«Спасибо за внимание».